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植物反应器生产口蹄疫疫苗的研究进展

时间:2014-10-01 16:37:12  来源:  作者:常惠芸; 侯顺利

口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种烈性传染病,主要感染偶蹄兽,患病动物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水疱,破溃形成烂斑。由于猪、牛、羊等主要家畜均可感染此病,并能形成规模流行,因而国际兽疫局(OIE)将该病列为A类家畜传染病之首。 防制口蹄疫的方法大致有三种,一是严格检疫及封锁疫区;二是扑杀疫区内的病畜和易感动物,并进行彻底消毒;三是广泛免疫预防。人工免疫常用的疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗两种。弱毒疫苗有较好的免疫力,免疫持续时间长,疫苗接种量少,价格低廉。对FMD而言,尽管有多种弱毒疫苗,但效果都不够理想。因为口蹄疫病毒弱毒疫苗的毒力常随动物的种类不同而不同,如对牛毒力很低的疫苗株,可能对猪或羊仍然有致病力,而且同一种弱毒疫苗在同种动物的不同品种、不同年龄及不同生理状态也常表现不同的毒力;弱毒疫苗中的活病毒在动物体内长期存在,一旦毒力增强,有可能对周围的其他易感动物构成威胁。国际上已有多起由于使用弱毒疫苗而引起FMD暴发的报道。因此,许多国家已明文规定禁止使用弱毒疫苗。灭活疫苗克服了弱毒疫苗的一些弱点,在许多国家都收到了良好的预防效果,但其接种量较大,免疫持续时间相对较短;再加上疫苗制造过程中的一些人为原因,近年来国际上发生过多起FMD暴发的原因似与灭活疫苗中的残留病毒或感染性核酸有关,在这种情况下促进了人们进行基因工程疫苗的研究。 近十几年来,随着生物技术特别是植物基因工程领域的研究进展,使人类获得了操纵外源基因在植物中表达的能力。1992年Mason等率先提出了用植物反应器生产疫苗的新思路。此后,许多实验室相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙型肝炎表面抗原、大肠埃希氏菌热不稳定肠毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒衣壳蛋白、呼吸道合胞病毒抗原和狂犬病毒G蛋白等抗原,并利用在植物中表达的动物和人的免疫试验,获得了大量有价值的研究数据,为今后利用植物反应器生产疫苗奠定了基础。

 1 植物反应器生产疫苗的原理和方法 随着生物技术的高速发展和植物细胞培养及再生方法的日益完善,人们不仅在改造植物本身的遗传性状及创造新品种方面取得了令人瞩目的成就,而且在把植物作为新型的天然生物反应器(natural bioreactor)生产药物、抗体、疫苗等有重要经济价值的外源蛋白方面也取得了可喜的进展。利用转基因植物生产疫苗,是将抗原基因导入植物,使其在植物中表达,人或动物摄取该植物或其中的蛋白质后,就可产生对某抗原的免疫应答。植物反应器生产疫苗主要包括以下过程:目的基因的获得;植物表达载体的构建,即将抗原基因插入到植物表达载体(如pBIl21质粒)中;再通过直接法(基因枪法、电击法等)或载体法(农杆菌介导法、脂质体介导法等)将含有目的基因的表达载体导入植物细胞,外源基因随即整合入植物基因组中;选择转基因植物再生;表达水平的检测。在获得目的基因的整个过程中,植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是植物反应器生产疫苗的关键技术。

1.1 植物遗传转化的受体系统及其特性

1.1.1 植物组织受体系统 受伤的细胞易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些DNA通过不同的方式转移到受伤细胞中,并形成愈伤组织,用愈伤组织可以培养成完整的转化植株。该受体系统转化率高,可获得较多的转化植株,取材广泛、适应性广,但再生植株变异较大,转化的外源基因稳定性差,嵌合体多。

1.1.2 植物细胞原生质体 是植物细胞除去细胞壁后的部分,是一个质膜包围的"裸露细胞"。原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并生成完整植株的能力。原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作,相互之间可以发生细胞融合,而且还可以直接高效地捕获外源基因,缺点是嵌合体少,遗传稳定性更差,培养周期长,难度大,再生频率低。

1.1.3 生殖细胞受体系统 是以植物生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。目前主要以两个途径利用生殖细胞进行基因转化,一是利用组织培养技术进行花粉细胞和卵细胞的单倍体培养,诱导愈伤组织细胞,进一步分化发育成单倍体植株,从而建立单倍体的基因转化系统;二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化,如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。由于该受体系统具有更强的接受外源DNA的潜能,一旦将外源基因导入这些细胞,犹如正常的受精过程。利用植物自身的受粉过程,操作方法方便、简单,不足之处是利用该受体系统进行转化受季节的限制,只能在短暂的开花期进行,且无性繁殖的植物不能采用。

1.2 植物遗传转化的载体系统 作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。目前的载体系统有病毒的载体系统和质粒的载体系统两大类。

1.2.1 病毒载体系统 植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。以病毒作载体的表达体系,统为瞬时表达系统,一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。植物病毒的感染率很高,在较短时间内可获得较大的表达量。但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体,故瞬时表达系统不易起始。作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。目前已有十几种植物病毒被改造不同类型的外源蛋白表达载体,包括椰菜叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)、虹豆花叶病毒(CPMV)和马铃薯X病毒(PVX)等,其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。

1.2.2 农杆菌载体系统 近年来,农杆菌一直是世界各国科学家研究的特点,与植物转化有关的农杆菌有两种类型:一种为根瘤农杆菌(Agrobacten'um tumefaciens)它含有丁i质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发产生冠瘿瘤(crown gan);另一种为发根农杆菌(A。rhizogenis),它含有Ri质粒,能诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根,形成茎瘿瘤(cane pn)。Ti质粒(含凡质粒)上有一段转移DNA(transfer DNA,又称T-DNA)。在农杆菌侵染植物时,这段DNAR移是指T i或Ri)质粒上的DNA被加工、切割、复制、越过细菌膜进入植物细胞被整合到植物基因组的全过程。植物基因转化必须有Ti质粒上T-DNA和Vir基因即毒性区两部分的参与,T-DNA的边界序列和Vir区域是T-DNA的转移和整合到植物所不可缺少的。T-DNA的边界序列在整合过程中边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中,而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程,因而可以用外源基因将其替换。vir区大小为30kb,分为virA、B、C、D、E、G、H等7个操纵子,一共有24个基因共同控制着T-DNA的加工和转移,它们总称调控子。由于Vir基因在植物基因转化中起着越过细胞膜进入植物细胞的作用,因此在建立载体时必须含有完整的Vir基因。此外,该载体含有T-DNA的边界序列而且这个质粒还能在大肠埃希氏菌和农杆菌之间进行穿梭。目的基因在转化酶的作用下与双元载体连接后,转化至大肠埃希氏菌中,大量增殖分离、纯化并迁移到癌农杆菌中,然后在含有抗生素的选择培养基上与相应的植物细胞共同培养,在癌农杆菌中目的基因整合到植物细胞染色体中,并随同植物的遗传而获得稳定的遗传性状。

1.3 植物遗传转化方法 植物遗传转化方法可分为两类。一类是载体介导的转化,即利用另一种植物实现基因的转入和整合。目前这种载体有质粒载体和病毒载体两种,即通过机械接种感染植物的病毒载体转化方法和通过农杆菌质粒介导的基因转化方法。由于农杆菌质粒介导的基因转化方法的稳定性、重复性好,设备简单,操作方便,故应用广泛。另一类转化方法是基因直接转化,不依赖农杆菌载体和其他生物媒体,将特殊处理的裸露DNA直接导入植物细胞实现基因转化,因此也称为无载体DNA介导转化。其中基因枪法最常用,而且操作简单、快速,缺点是转化频率低。

2 转基因植物可食疫苗与黏膜免疫反应 可食疫苗能成功地诱导黏膜免疫反应(mucosal immune system,MIS)。黏膜免疫反应是人类和动物最初感染病原的最主要和有效的表面防卫系统,位于消化道、呼吸道、尿道、生殖道的表面。小肠淋巴组织黏膜M细胞可进行抗原识别而诱导黏膜免疫反应。M细胞把抗原传递到抗原呈递细胞(APC),吞并加工抗原,这样抗原表位被呈递到抗原呈递细胞表面,在辅助性T细胞的帮助下,激活B细胞。被激活的B细胞移动到肠系膜淋巴结,在此发育为成熟的血浆细胞,然后移动到黏膜分泌出IgA。在通过黏膜上皮层到细胞腔的过程中,IgA分子复杂化,与膜结合分泌因子形成分泌型IgA(SIgA),SIgA在细胞腔与特异性的抗原表位作用而中和入侵的抗原。一般来说,通过口服产生的黏膜免疫反应比通过注射产生的黏膜免疫反应效果好。与皮下注射免疫相比,使用亚单位或可溶性抗原口服免疫效果较好,而且需要的抗原量也少。

3 植物反应器生产口蹄疫疫苗的研究进展

3.1 Carrillo等将FMDV VPI基因转化到拟南芥(Arabidopsls thaliana)中;用转基因植物叶的提取物注射于小鼠,免疫动物对VPI区135~160合成肽、结构蛋白VPI和完整病毒粒子均可产生特异的抗体反应,免疫小鼠均对病毒攻击产生保护。这是首次利用转基因植物表达抗原引起动物产生抗病毒的免疫反应。

3.2 Wigdorovitz等将FMDV VPI(OIC)插入烟草表达载体中,用转基因植物叶提取注射于小鼠,免疫小鼠均对病毒攻击产生保护。

3.3 Wigdorovitz等还将FMDV VPI基因克隆到双元植物表达载体中,在根瘤农杆菌的介导下转化到苜蓿中,VPI基因在苜蓿中能有效表达。用转基因植物叶的提取物注射小鼠和用新鲜叶直接饲喂小鼠均可产生抗病毒特异免疫反应,免疫动物对VPI区135~160合成肽、结构蛋白VPI和完整病毒,粒子均可产生特异的抗体反应,免疫小鼠可以耐受病毒攻击。该试验为利用转基因植物生产动物口服疫苗提供了有力的支持。

3.4 Carrillo等将FMDV VPI插入马铃薯表达载体中,VPI基因在马铃薯中能有效表达。用转基因马铃薯口服饲喂试验动物,免疫动物能够产生抗FMDV特异抗体,并耐受强毒攻击。试验证实,用植物反应器生产疫苗,可以避免抗原浓缩或纯化的烦琐步骤。作者在提高VPI基因在植物表达量的试验中,采用花椰菜花叶病毒一元启动子(pPok2)和双元启动子(pPok3)转化马铃薯,结果无明显差异。

3.5 我国利用转基因植物生产口蹄疫疫苗的研究起步较晚。北京大学李毅教授已将FMDV结构蛋白VPI基因插入植物表达载体中转化玉米,目前正在做检测工作。中国农业科学院生物研究所、作物研究所和草原生态研究所利用大豆和马铃薯表达FMDV结构蛋白的研究工作也已启动。 4 植物反应器生产疫苗的优缺点及评价

4.1 转基因植物可食疫苗遗传性状的评价 可食疫苗植物是否获得稳定的含外源蛋白基因的遗传性状,可通过检测转化植物中是否含有可表达的外源基因所表达的相应的产物来评估。可在转化植物的各个阶段进行检测,及时淘汰未转化的植株,为下一步转化植物的筛选提供依据,如检测转化植物中是否存在外源基因和拷贝数的多少,可应用PCR和Southern杂交方法。植物反应器作为疫苗生产系统研究较多的是马铃薯,人用疫苗采用香蕉和番茄,其他植物各有其优缺点。

4.2 转基因植物作为疫苗生产的生物反应器的优点 它为人类提供了一个安全和廉价的疫苗生产体系,与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比,它具有许多潜在的优势:①植物细胞具有全能性,能够再生植株,转基因植物的种植不需要特殊技术和复杂的生产设备、设施,只要有阳光、养分和水,就可通过大面积栽培转基因植株进行大规模生产,是最经济有效的疫苗生产系统;而细菌在发酵过程中常产生一些不溶性聚合物,将这些聚合物重新溶解并折叠成天然蛋白质,需要很高的成本。并且部分转基因疫苗可直接口服,既节省了提取、纯化和保存成本,又免去烦琐的接种程序,节省免疫器材和接种费用。②与动物细胞比较,植物培养条件简单,便于遗传操作,并可克服微生物系统不能对真核生物蛋白进行准确翻译后加工和蛋白的糖基化,使三维空间结构更趋于自然状态,表达产物具有与动物病毒抗原相似的免疫原性和生物活性。③常规疫苗和其他新技术疫苗在大规模培养过程中,很容易发生病原性细菌污染,特别是霉形体污染极其普遍,而转基因植物疫苗不含致病微生物或潜在致病微生物,免除了使用活病原的风险和疫苗的灭菌问题,对人畜安全,不会引起负反应。④转基因植物疫苗不需要特殊容器分装,不需低温保存和冷藏运输。⑤转基因植物疫苗在生产过程中不会对环境产生任何污染,还有绿化、美化环境的作用。⑥转基因植物中外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组,进而生产一种方便、高效的多价口服疫苗。 4.3 植物反应器生产疫苗也存在一些问题 植物反应器生产的疫苗表达量不高,口服时易被消化,是否引起动物过敏和免疫耐受还须进一步研究。 利用转基因植物生产疫苗,提供了口服疫苗最经济有效的来源。从长远观点来看,植物将作为生产新型疫苗的反应器,在未来的疫苗和药物生产中可能占一定地位。应用动物饲料如马铃薯、苜蓿、谷物类等植物表达的抗原饲喂动物,均可直接作为口服疫苗,这种仅靠饲喂某些草料就可预防某些传染病的技术,相信在不久的将来定会成为现实。

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