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新城疫病毒分子生物学最新研究进展

时间:2015-01-14 17:41:15  来源:  作者:王忠田; 王泽霖

随着NDV分子生物学研究的日益深入,人们发现NDV不同毒株之间的免疫原性和毒力主要与其F蛋白和HN蛋白有着密切的关系。这就有必要对NDV的分子生物学水平进行全面系统的了解和研究。

1 NDV的分子生物学特征

1.1 NDV的基因组特征 NDV是一单链负股RNA病毒,其基因组长度约为15kb,分子量约为51-57kDa。病毒感染细胞后,基因组产生三组RNA,沉降系数分别为18S,22~28S和35S。35SRNA为一个单一的mRNA片段,编码L蛋白。分子量为220kDa。18SmRNA含有基因组中所有剩余的独特的mRNA,可分别能编码M,HN,F,NP,P五种蛋白。Northern杂交证明,18S和35SmR-NA包含了所有的编码区域,而28S包含了18SRNA的编码区域,表明它可能是18S的共价连接产物。22SmRNA不含特异片段,但转录产物与18S相似,代表多顺反子信息。病毒基因组有98.8%被转录成上述六种蛋白的mRNA,各基因组间有一个3'-GAA保守序列。NDV mRNA的转录是以A开始的,在各组mR-NA之前均有一个保守的起始信号3'-UGCCCAUCU-U-5'。且每一基因末端含有转录的终止信号序列,即3,-AUUCUUUUUU-5'序列和与mRNA互补的polyA。mRNA的起始信号和poly A之间的距离不等,通常在1-47个核苷酸之间。

1.2 NDV的结构蛋白特征 NDV有NP、P、M、F、HN、I六种病毒特异性结构蛋白。其中HN蛋白与F蛋白是重要的宿主保护性抗原。

1.2.1 F蛋白 F基因从其转录起始信号到PolyA 尾巴约有1 790个核苷酸。F基因有一个开放阅读框D1。其转录的起始信号是ACGGTAGAA,在1 783、1 786位含有与真核生物相同的终止密码子TA(A)G。病毒的F基因转录、翻译成F蛋白。F蛋白由553个氨基酸组成,分子量为59.66kDa。它位于病毒的囊膜上,主要负责病毒与易感细胞发生融合、进入细胞和产生溶血。F蛋白的前体FO在细胞内被细胞的胰蛋白水解酶裂解为Fl和F2两条多肽链,分子量大小分别为55kDa和12kDa。它们以羧基端嵌合在病毒囊膜上。两个亚单位以二硫键连接,其顺序为NH2-F2-S-S-Fl-COOH。裂解后的F1多肽的N端产生一个疏水氨基酸区域,直接参与融合活动。F2的高度疏水可能与融合作用有关。现在研究表明,F多肽有3个高度疏水区,即N端信号肽,F1的N端和C端跨膜区域。有五个糖基化位点,1个在F2多肽上,4个在F1多肽上。信号肽区和融合诱导区分别具有使蛋白跨膜转位和直接参与膜融合的功能。蛋白跨膜区具有终止蛋白转移和膜定位的功能。 Toyota等应用一组针对不同NDVF蛋白的单克隆抗体、抗原结构进行分析,认为F蛋白含有3个抗原决定簇,分别位于343,72和161位,其中位点I (Leu-343)位于Fl亚基C末端高度保守的半胱氨酸富集区,在病毒的抗原性及结构和功能上起重要作用。F1和F2裂解位点之间有一个半胱氨酸残基,有利于位于F2亲水区的位点II(Asp-72)同F1N末端接近,形成与抑制融合相关的抗原表位。位点III(Thr-16)位于F1N端,与前两个位点相比,该区的亲水性较低,被认为是病毒的融合体,它使病毒与细胞之间通过疏水作用而融。

1.2.2 HN蛋白 NDV的FIN基因全长2.0kb,基因序列中有一个长的开放式阅读框,通常编码577个氨基酸,推测其分子量约为6.3kDa。HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性,在病毒侵染过程中起着识别细胞受体、介导病毒吸附细胞膜的作用。NDV可被HN单抗和特异性HN蛋白抗血清所中和。应用单抗研究表明HN蛋白的血凝素和神经氨酸酶两个位点在抗原性上是独立的。HN蛋白氨基酸序列中有六个潜在的糖基化位点,主要疏水区靠近N端,表明HN是以N端与病毒外膜相连的。多肽N端一侧的极性氨基酸亲水性分析表明缺乏裂解信号。糖基化作用对FN向膜转运无作用,但对神经氨酸酶的作用是必需的。Mcinnes和Morrison对NDVAV株的HN蛋白的六个糖基化加成位点进行突变研究表明,糖基化对蛋白质的折叠及活性有重要作用。

1.2.3 NP蛋白、P蛋白和L蛋白 NP蛋白、P蛋白和L蛋白与病毒基因组RNA相结合构成病毒核衣壳。NP蛋白有2个主要区域,一是氨基酸区域,约占NP蛋白的三分之二,它与RNA直接结合;另一是羧基端区域,裸露在装配后的核衣壳表面,胰蛋白酶处理后,可以从核衣壳上解离下来。P和L蛋白与病毒基因组的转录有关,它们与病毒模板一起构成转录复合物。其中l蛋白是NDV基因组编码最大的蛋白,是一种病毒RNA依赖性的聚合酶。有证据表明,P蛋白是病毒特异的。

1.2.4 M蛋白 NDV的M蛋白是一个由346个氨基酸组成的多肽,分子量为39.7 kDa。Yoshida等通过试验认为,在M蛋白和膜内糖蛋白之间存在着特异的识别位点。Peeple和bratt提出M蛋白与融合糖蛋白(F)之间的重要相互作用对于有感染性的病毒粒子的形成是必需的。除上述蛋白外,NDV基因组还编码两种非结构蛋白,分别为33 kDa和36kDa,大概是由P蛋白的同一框架编码的。

2 NDV致病的分子基础 随着分子生物学技术的发展,近年来对NDV的分子结构与致病性的关系进行了深入研究,发现了不同致病性毒株在分子结构上的差异揭示了NDV不同毒力的分子生物学本质。 自1986年Chamber等第一次报道NDV的核苷酸序列以来,已有大量文献陆续报道了NDV不同毒株的基因序列。经NDV结构蛋白多肽指纹图谱分析发现,所有NDV毒株NP,P,L蛋白分子结构基本一致,而F,HN蛋白氨基酸却存在较大差异,并且毒力差异越大,F,HN蛋白氨基酸差异也越明显。遗传学分析表明:当弱毒株Lasota的变异株毒力增强时,其NP,P,L,M,HN蛋白均无明显的差异,而F蛋白的存在形式却明显改变。这一结果表明,NDV糖蛋白尤其是F蛋白在NDV致病性上发挥着重要作用。Peeters等在1999年再次报道了F蛋白是一主要决定毒力的蛋白。Marakami利用杆状病毒表达系统研究NDVHN和F蛋白时发现,单独表达HN或F蛋白时细胞没发生融合,而当HN与F基因在同一细胞中表达时,却有明显的合包体出现。Morrison等也报道了同样结果。这表明决定NDV毒力的主要因素是F蛋白,其次是HN蛋白,并且二者有密切的联系。 NDV的F蛋白先是以惰性前体FO的形式合成,当它转运到高尔基体表面时,被宿主细胞蛋白酶裂解成F1、F2两个亚单位,使病毒具有感染活性。裂解后的活性蛋白一旦到达质膜表面即可介导感染细胞与邻近细胞的融合,并导致病毒新的感染。 F蛋白裂解位点位于112-116位的氨基酸处,其氨基酸顺序及裂解能力是决定毒力的关键。Collins等对26个NDV毒株进行核苷酸序列比较发现,所有强毒株F蛋白裂解位点的氨基酸组成都是被由谷氨酰胺隔开的碱性氨基酸对组成;而弱毒株或无毒株相应的裂解位点碱性氨基酸对的第一个残基被Gly取代,另外,强毒株P1多肽首位残基是Phe,而弱,毒株的该残基则被Leu取代,即强毒株的切割顺序一般为112RRQK/RR/F117;而弱毒株的通常为112GR/KQ-GR/L。这就是NDV毒力强弱的关键所在。

3 NDV分子诊断技术研究进展 近年来,在NDV的诊断中出现了"非典型ND",使常规的HA,HI,ICPI,鸡胚接种,中和试验等不能满足生产实践的要求。因此,人们试图从核酸水平检测NDV并对强弱毒株进行区分。其中主要有RNA指纹图谱法,核酸探针法,裂解位点分析法及其多肽抗体法和PCR方法。Mcmillar等首先用RNA指纹图谱法对Lasota株进行了分析。其方法是用T1RNase降解病毒RNA,然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行二维电泳并放射自显影,得到RNA各片段的分布图,并提出作为NDV检测和分析的一种手段,随后他们又对许多株进行了分析,确定了其图谱和同源性。 Jarecki-Black设计了与NDVF基因5'端非编码区互补的核苷酸探针,用该探针检测了14个NDV毒株,包括强毒,中毒和弱毒,都出现了极好的杂交,同时该探针不与禽流感病毒(A)V),传染性支气管炎病毒(1BV),传染性法氏囊病毒(1BDV)杂交,说明该探针是特异的。1993年他又设计了两个探针,该探针的长度为21个碱基,与强毒株TEXASGB的F蛋白的裂解位点基因互补,可与11个速发性毒株,5个中发性毒株的RNA杂交,而不与所有的7个弱毒株的RNA杂交,这说明该探针能将弱毒株从强毒株和中毒株中区分出来,具有重大的应用价值。Angela等(1998)利用RT-PCR扩增出362bp的包括F蛋白裂解位点序列的片段,制备成了相应的探针,并用PCR产物同型特异性探针杂交来区分德国流行的强弱毒株。 Hodder等利用强毒株Australia-Victorta(AV),弱毒株Queenstand(U4),Eaves-Grimes(EG),WA2U6株的裂解位点的氨基酸的组成和序列不同,设计并人工合成了两个多肽,针对强毒株的序列为Ser-Gly-Arg-Arg-Gln,针对弱毒株的序列是:Ser-Gly-Gly-Glu-Arg-Glu-Glu,将这两个多肽分别与载体连接制备兔抗血清,用抗血清可以区分不同毒株的毒力强弱。王树双等利用相似的方法,通过免疫印迹对6种不同抗多肽抗体分析了国内现有的部分毒株毒力的强弱,结果与接种鸡胚致死情况基本吻合。 PCR是一种体外扩增特异性基因片段的技术,在疾病的检测方面有着广阔的应用前景,现已被广泛应用。Jestin设计一对分别为18和19个碱基的引物,分别对应于NDVF蛋白/基因的一定区域,扩增出一个238bp的片段,产物经酶切鉴定,证明是特异的,能用于NDV的诊断和检测。宋长绪等等也设计了针对NDVF基因裂解位点的引物,可以以强、中、弱毒株核苷酸为摸板,扩出一个480 bp左右的片段,对IBV、EDS-76的核苷酸而扩增不出,说明该PCR方法是对NDV是特异的,可以用来诊断和检测NDV。Kant.AL24J(1998)利用4条引物A,B,C,D配成AB,AC,AD三对,AB针对所有毒株,AC针对强毒株,AD针对弱毒株,分别对只通过组织匀浆而提取的NDV-RNA进行RT-PCR,结果扩增出362,254,254bp的三个片段。他用RT-PCR方法对11个NDV强毒株,4个NDV无毒株进行扩增,结果证明,该方法与传统方法检测结果基本吻合。该方法不需要鸡胚接种,节省了时间,24h之内便可以出结果,为NDV毒株的区别诊断提供了手段。但这种方法要求病毒滴度至少在10sED50/mL。而套式PCR会增加灵敏度,但是套式PCR方法易交叉污染。

4 NDV基因工程苗研究 疫苗接种是防制ND的有效措施。目前,常用弱毒苗和油乳剂灭活苗免疫。弱毒苗价格低、效果好,但易导致病毒散播;灭活苗安全可靠,但存在免疫期短、成本高、使用较复杂的缺点。NDV血清型单一,主要靠体液免疫。亚单位苗保护率高。因而ND基因工程苗的研制已成为国内外研究的热点。 Epsion等将Italian株的F蛋白基因插入痘病毒的基因组中,并置于P 7.5转录控制序列之下,用CV-1细胞进行共转染,使F蛋白在细胞表面获得了有效的表达。Meulemens用此重组病毒分别对1日龄雏鸡和成鸡进行了免疫,尽管免疫效果很好,但其缺点是明显的,即痘病毒对人类的健康构成潜在的威胁。Bourshel![27]将Beaudettec株的HN基因插入禽痘病毒的一个非必需区,置于痘病毒P7.5启动子的控制之下进行表达,产物分子量大小与设计结果完全相符,用HN单抗进行Western-blot也能检出表达产物,用表达产物静脉注射或翼下刺种免疫鸡,可以抵抗NDV强毒的攻击,保护率达100%。Nagy等将B1株的HN基因插入杆状病毒表达载体,重组的HN基因在粉纹夜蛾细胞中获得了表达,表达产物表现HN活性,而且其HN活性能被NDV多抗或抗HN单抗所抑制。提纯的HN蛋白免疫鸡,产生的抗血清在ELISA和Westernblot反应中与NDV产生特异反应。Mori等利用昆虫杆状病毒作载体表达D 26株F基因,能够表达出分泌到细胞膜表面的F蛋白。用重组病毒感染蚕蛹,制备出的NDV亚单位疫苗,可以抵抗NDV强毒的攻击。 Morgan等LaOJ将NDVF基因和HN基因分别插入HVT的一个非必需区中,插人的基因受劳斯肉瘤病毒(RouseSarcoma)长末端重复序列的强启动子启动,重组HVT株稳定,且能完全感染鸡和离体培养的细胞。家禽1日龄腹腔内一次接种带有F基因重组HVT,能够产生免疫反应并在28日龄时用NDV攻毒保护率大于95%。而接种表达HN蛋白的重组HVT的鸡保护率只有47%,重组HVT和亲本在用超强毒MDVRB,B株攻击时,对鸡产生相同的保护,这说明外源基因的插入不影响HVT对MD的保护作用。张秀根等将NDVF蛋白基因插入到HVTTK基因的NheI位点,构建转移载体质粒pTKF与HVT重组后,转染CEF细胞,经Western-blot检测,发现细胞上清和细胞中均可检测到F蛋白,用表达的蛋白给1日龄雏鸡腹腔注射,结果表明重组HVT可诱导产生较高的抗F蛋白ELISA抗体,且可明显降低NDV强毒攻击引起的发病率和死亡率。 NDV的分子生物学研究已取得相当大的成就。F基因和HN基因序列已基本弄清,与它们相对应的F蛋白和HN蛋白是与NDV致病性和抗原性有密切的关系的蛋白。有关它们的克隆与表达将会更进一步深入。NDV基因工程疫苗将有广阔的开发前景。相信在不久的将来,NDV基因工程疫苗必将以其独特的优势为控制及消灭ND作出贡献。

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