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禽法氏囊三肽囊素免疫生物学及其同功能单链抗体研究进展

时间:2015-01-14 17:39:56  来源:  作者:邬向东; 谌南辉

从1988年Bird第一次报道大肠杆菌能正确地装配抗体的Fab和Fy片段并使之保留原抗体的特异性,至今利用基因工程技术构建单链抗体基因,已经是相当成熟的技术;但在动物医学领域仍鲜有研究,而无病原因子污染的方式生产出Bursin-ScFv应是该研究的发展方向。

1 禽法氏囊及其功能 法氏囊(BF)是禽类特有的免疫器官,是意大利解剖学家FabriciusH所发现,故称法氏囊。它位于禽类泄殖腔的背侧后上方,又称为腔上囊。BF为B细胞发育、成熟提供微环境,是禽类特有的免疫球蛋白基因转变(Geneconversion)场所,由此获得抗体的多样性。BF除具有中枢免疫器官地位外,还作为外周免疫器官发挥作用。1996年张红卫等以手术摘除法获得无BF仔鸡,研究鸡脾脏B细胞的发育,结果证明鸟类脾脏B细胞主要来源于BF。来自骨髓的多功能干细胞,经血流进入法氏囊后,在称为囊素(bursin)的诱导下,分化成为囊依赖性淋巴细胞简称B细胞,经淋巴和血液的循环移至外周免疫器官的非胸腺依赖区并继续增殖,参与体液免疫。据研究证实,囊激素为一种三肽物质,分子结构为Lys-His-Gly-NH2,故又称为三肽囊素(Bursin)。

2 禽法氏囊免疫活性物质研究 关于BF中免疫活性因子的研究,1960年Glick等首次发现法氏囊提取液(BE)能提高雏鸡对绵羊红细胞产生的抗体水平。1976年Baba等发现BE能够使胚胎期切除法氏囊的雏鸡法氏囊复生,并恢复产生特异性抗体和免疫球蛋白。1977年Baba等又报道了法氏囊提取液可恢复丙酸睾酮(TP)抑制BF发育鸡的抗体水平及IgG;的生成能力。1976年,Brand等由体外实验研究鸡骨髓干细胞的早期分化,证实BE可诱导B细胞和T细胞的分化,用其低浓度亦可很强地引起B细胞发生分化,其化学成分为低分子多肽,称其为Bursopoietin。1981年高舜德等亦进行了BE对BF复生的研究,结果表明BE注射愈早,对BF的复生作用愈大,从而证明BE有促使BF发生的作用。1993年王兴金等亦证实BE经口服或肌注,均显著提高鸡产生特异性抗体的能力,并能对环磷酰胺(CP)造成的免疫抑制有明显的拮抗作用,其免疫增强作用与BE的剂量相关。另外,1991年郑昌学、高奋标从北京鸭BF中获得的提取物能显著提高小鼠脾脏内空斑形成细胞(PFC)数目,还具有对抗B细胞抑制剂CP的作用,能提高小鼠脾细胞cAMP含量,以及具有增多胸腺细胞E-玫瑰花环形成数目的活性,并称其为Bursatin,经分析很可能是肽类物质;从Bursatin部分纯化的促PFC的活性因子的分子量小于750kDa。1996年李从壁等以高于正常免疫剂量5倍的法氏囊炎疫苗免疫二次,于免疫高峰时提出BF,自BF中分离出一种分子量小于10kDa的物质,为多肽和核苷酸的混合物,称为免疫法氏囊活性因子,理化性质类似于转移因子,具有促进淋巴细胞增殖,特别是T细胞活性的功能,有依赖抗原的特异免疫活性。

3 三肽囊素(Bursin)研究进展 1986年AudhyaT等首次从鸡BF抽提液中纯化出定名为Bursin的物质,其化学组成为三肽,即赖氨酰-组氨酰-甘氨酰胺(Lysyl-Histidyl-Glycyl-Amide)。其生物功能显示,能诱导家禽和哺乳动物B细胞前体分化,能提高人B细胞系Daudi细胞内cAMP和cGMP水平,而对人T细胞系CEM却无上述活性作用这项研究成果对BF中免疫活性因子的研究具有十分重要的意义,这是迄今为止第一个自BF中分离出有关诱导B细胞分化能明确其结构的因子,确定为B细胞选择性分化激素。随后,1989年GI Viamontes等制备出抗Bursin抗血清,以免疫组化法,确定Bursin分布于BF滤泡皮髓质分界上皮(CME)、树状网状上皮细胞(DREC)及滤泡表面上皮(WSE)基底膜中,而其他器官为阴性。至1990年TAudya等有新的发现,证实Bursin不仅存在于鸟类BF上皮中,还存在于鸟类、哺乳类骨髓以及哺乳类肝脏胆管上皮细胞中;又于1991年自牛骨髓和肝脏分离出前囊素(Probursin),为十四肽结构(Phe-Phe-Trp-Lvs-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg),其顺序9~11却与Bursin一致,且具有Bursin相同的生物学活 性。早于1973年LPickart等自大鼠肝脏分离出一种增殖因子,具有与Bursin类似的三肽结构(Gly-His-Lys)。 1997年谌南辉等建立抗Bursin单抗2F9-4株,以该单抗,用免疫组化法,检测Bursin在鸡体的定位分布,结果表明,Bursin不仅分布于BF,且广泛性存在于胸腺Hassa U小体、哈德氏腺、脾脏、BFT细胞区及骨髓;亦不仅在出雏后,且于胚胎期呈阳性结果。由此表明,Bursin不仅局限于BF的范畴,也不局限于禽类,因而具有更为广泛的免疫生物学意义,特别是对功能至今仍不完全清楚的胸腺Hassall小体赋予了新的概念和传递了新的信息。 1997年大坪裕子等对CB鸡胚胎期BF淋巴滤泡形成的研究,发现Bursin在间充质的定位早于B细胞分化标记Bu-1(ChB6)阳性细胞出现之前,因而推测Bursin在间充质中的定位对B细胞在滤泡中分化显示出有意义的影响。 1998年张秀根等改进了以往制备BE的方法,制备出分子量更接近三肽的活性物质,并证实该物质的靶器官是BF,能够拮抗IBD疫苗对BF的损伤,能显著提高ND弱毒疫苗及油苗产生的抗体水平,促使母源抗体保持较高水平,促进BF生长发育,以及促进损伤后的BF的修复。 1999年张秀根等进一步证实人工合成纯Bursin作用的靶器官是BF,促进BF生长发育,促进特异性抗体的产生,维持母源抗体的作用;其作用在应用早期比晚期强。1999年王川庆等在IBD疫苗、ND疫苗中试用人工合成纯Bursin,结果表明,可提高ND的抗体水平2个滴度以上,攻毒保护率达100%,对IBD除可促进抗体的产生外,还能提高攻毒保护率20%,并能减轻强毒IBDV攻击所造成的BF损伤。研究结果还表明,Bursin主要通过刺激BF淋巴细胞滤泡及其淋巴细胞的发育、增生,提高抗体产生水平、促进T淋巴细胞的转化活性等而发挥其提高机体免疫力,增强免疫效果的作用。

4 三肽囊素同功能单链抗体(Bursin-Single ChainFv,Bursin-ScFy)研究前景 三肽囊素(Bursin)的生物学功能目前已经得到大多数学者的认可,未来几年中,三肽囊素(Bursin)在家禽生产中的应用将成为新的热点。但目前对于三肽囊素(Bursin)的获得还仅限于物理提纯和化学合成,这些方法要么因需避免病原污染而要使用来自SPF鸡群的BF;要么人工合成。其成本必定很高,造价昂贵而影响生产中的应用。而应用基因工程抗体技术来大规模生产,肯定是其未来发展的方向。构建三肽囊素同功能单链抗体(Bursin-ScFv)就是其中方法之一。

4.1 抗独特型抗体理论及实践应用 抗独特型抗体是本世纪70年代后期发展起来的一种新型免疫生物制剂。其理论根据是,机体针对抗原性物质产生的抗体(Abl)具有双重性,其抗原结合段(Fab片段)做为抗体可识别抗原,而做为抗原,它又可刺激免疫活性细胞产生抗Abl的抗体(Ab2),因此Abl又可被Ab2所识别,通常便把Ab2称为抗独特型抗体,这种抗独特型抗体具有始动抗原性物质的作用,是因为它们之间具有相似的三维空间折叠结构(即相同的内映像),携带着与天然抗原一样的决定基,给动物注射后,便可产生天然物质相同的生物学功能作用。目前应用这项技术除主要适用于制造疫苗外,还可进行生物受体(包括激素、维生素、神经递质、病毒受体)的研究等。

4.2 单链抗体(SingleChainFv,ScFv)特性 1988年Bird等第一次报道,大肠杆菌能正确地装配抗体的Fab和Fy(由抗体重链、轻链可变区构成,即由VH和VL构成)片段并使之保留原抗体的特异性。组成Fv片段的VH、VL是靠非共价键联系结合在一起的,同时缺乏任何链间二硫键,因而尽管有高度保守的可变区骨架序列,Fv异源二聚体片段的稳定性变化很大,易分解成VH和VL分子,而丧失其功能。为此通过人工合成或天然的连接肽序列将VH和VL共价连接起来,形成较高稳定性的单链抗体片段,即VH-Linker-VL或VL-Linker-VH的顺序组成。实验证明,15个氨基酸的连接肽效果最好。这种基因工程抗体,不但可以克服异源性,减少免疫原性,还由于分子量小,可以克服机体的天然屏障,进入组织内发挥作用,且仍保持特异性,是理想的导向载体。

4.3 具三肽囊素同功能单链抗体(Bursin-ScFv)研究前景 利用基因工程技术构建Bursin-ScFv基因,然后整合于适当的表达系统中进行表达,就可以通过物质发酵技术大规模地生产,获得大量Bursin-ScFv应用于实践。 目前ScFv在表达方面,已经有很多成功的例子:Eldin等1997年用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达ScFv获得成功,其表达产量较大肠杆菌系统更高,达250mg/L,而且其表达的可溶性ScFv可以正常分泌至培养物上清液中,其纯化产物与细菌表达的ScFv亲和性无区别。国内王字玲等于1998年成功地进行了黑色素瘤特异性McAb HB8760单链抗体的基因表达;武国军等E26]在2000年成功对抗前列腺特异性抗原单链抗体/人羧肽酶A融合基因的克隆表达载体pGEX-4T-1中进行表达,表达量达到菌体总蛋白的34%;王长军等在2001年将抗人红细胞血型A抗原单链抗体进行原核表达获得成功,其表达产物主要以不容性包涵体形式存在,光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体蛋白的16.2%,免疫印迹试验显示,重组小分子抗体保留了亲本单克隆抗体的特异性亲和力。 由此可见,Bursin-ScFv前景十分可观,经基因工程技术构建并克隆出Bursin-ScFv基因,经过整合载体转化到受体细胞进行高效表达,就可既克服异源性,减少免疫原性,以低成本,无病原因子污染的方式生产出Bursin-ScFv,从而可大量供应生产和需要。

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