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昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望

时间:2014-09-27 17:30:58  来源:  作者:李卫国; 王厚伟; 牟志美; 石连辉

自80年代初,发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后,SmithandSummers(1983)首次建立了苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographa Califomica Naelear Polyhedrosis Vires,AeNPV)一秋粘虫(Spodoptera frujiperda,sf)细胞杆状病毒表达系统(Baeulovirus Expression Vectorsystem,BEVS)。利用家蚕可以大量饲养的特点,前田进于1984年建立了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)一家蚕(Bombyxmoil)表达系统,至今已有上千个基因利用该系统进行了表达和功能分析。昆虫杆状病毒表达系统(Baeulovirus ExpressionVector System,BEVS)已成为当今基因工程领域四大表达系统之一,与大肠杆菌、酵母、哺育动物细胞表达系统相比,BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(1)作为超高效的真核基因表达载体,生产有用的工程蛋白;(2)作为基因工程病毒杀虫剂,提高害虫防治效率;(3)研究杆状病毒基因组的结构与功能;(4)研究真核基因表达的调控机制。近几年来,昆虫杆状病毒表达载体系统已成为生产与研究各种原核和真核蛋白的有力而普及的工具。

 1 研究进展 由于昆虫杆状病毒环状双链DNA基因组很大(约130kbp),而且对限制性内切酶都具有多个识别位点,因而不能用常规基因工程操作直接将外源基因导入到病毒基因组中。昆虫重组杆状病毒的获得通常要分为两步进行。第一步,把外源基因克隆进通用载体质粒中,使外源基因处于杆状病毒强启动子的控制之下,而且左右两侧被杆状病毒DNA序列所包围。这些侧翼序列对病毒复制是非必需的,但在第二步同源重组时能发挥作用。第二步,把这一重组质粒DNA与野生型病毒基因组DNA一起导人昆虫细胞,在细胞内通过同源重组把外源基因插入病毒基因组(外源基因置换了位于两个侧翼序列之间的野生型病毒基因组基因,如多角体蛋白基因),通过特定的筛选方法和筛选标记,即可筛选出目的重组病毒。但BEVS系统亦有重组率低,筛选困难,工作周期长等不足之处。针对这些缺点,围绕着扩大BEVS的应用范围、缩短工作周期等,近几年从以下方面进行了研究改进。

1. 1 绿色荧光蛋白反向筛选标记系统 ?-半乳糖苷酶是一个常用的标志基因,Ayres曾用其构建了一个带蓝色白斑筛选的转移载体,但?-半乳糖苷酶基因较大,同时它的底物x-gal对昆虫细胞有一定的毒性,最近发现的水母绿色荧光蛋白(Green Flurescent Protein.GFP)及其特变体作为报告基因,具有检测手段简单,发光反应不需要其它蛋白和辅助因子及底物的参与,表达产物稳定等优点。已将其作为重组病毒的筛选标志引入杆状病毒的研究。首先将GFP基因通过常规的筛选获得GFP的重组病毒,以此作为亲本病毒与带有目的基因的相应转移载体进行共转染。纯化时在荧光照射下,显示绿色荧光的即为亲本病毒,而不产生绿色荧光的则为GFP基因被目的基因替换掉的目标重组病毒。

1.2 非重组失活转移载体筛选系统 Possee等发现,在多角体基因的下游存在一个病毒复制必需的基因ORF9(1629bp)。它编码核衣壳的一个组分。而在多角体基因的上游有一个病毒自下而上所非必需的基因ORF603。通过上述工作,设计了非重组失活转移载体。首先寻找一个在野生型病毒DNA上不存在酶切位点的限制性内切酶Bsu361,然而通过体外突变在ORF603和ORF9各引进一个Bsu36 1酶切位点,以此构建转移载体,将上述酶切位点通过同源重组的方式引入病毒基因组,得到一个在ORF603和ORF9含有Bsu361酶切位点的突变型病毒株BacPAK6。将用Bsu36 I酶切的BacPAK6 DNA与带多角体启动子、目的外源基因和复制必需基因ORF8的重组转移载体DNA转染昆虫细胞,若BacPAK6DNA自身.环化,则因缺失复制必需基因,病毒不能复制,只有重组病毒,亦即外源基因连同复制必需的基因重组到病毒DNA后,才能存活,重组率可高达80%或更高。但是病毒DNA经酶切线化后,其本身的感染力要比环状病毒DNA降低15-150倍,降低了共转染效率。

1.3 外源基因直接克隆产生重组杆状病毒系统 在AeNPVe6株全序列测定分析的基础上,发现病毒基因组上不含有I-ScaI酶切位点,I-scaI酶识别一个18bp的非回文对称序列,(酶解后产生一个3'端突出的3'-AT-TT-5'粘性末端),一般外源基因中几乎不可能有此位点存在。通过PVLl393转移载体将此酶切位点引入AcNPV的病毒基因组。得重组病毒Ac-Omega.Acoomega经I-Sce I酶切及脱磷后,与外源片段以摩尔比1:40的比例在体外进行连接,然而将连接的混合液转染昆虫细胞,进行挑斑纯化,分析表明,重组率达到95%以上。每微克病毒DNA可得到2x105个重组病毒"'。因此,此种方法非常适合于真核试验生物载体的eDNA表达文库和多肽文库的建立。

1.4 酵母一昆虫细胞穿梭载体筛选系统 Patel等发明了一种新的重组病毒筛选方法,主要原理基于在酵母中可以复制的杆状病毒基因组DNA和包含了酵母DNA片段及外源基因的转移载体在酵母Sacchromyces cerevisiae中发生重组,进而筛选出发生了重组的病毒DNA,重组病毒DNA经分离后转染昆虫细胞,形成重组病毒,表达外源基因。穿梭载体构建的主要过程如下:ARS为酵母的自主复制序列;CEN起有丝分裂中着丝粒的作用,保证质粒DNA能稳定地分配到子代酵母中去;URAB为选择标记基因。首先通过同源重组将上述三个基因重组到病毒基因组,这种病毒DNA既可在酵母中复制,亦能在昆虫细胞中复制。进而在酵母中将反选择标记SUP4-0重组到病毒DNA上,形成最终的穿梭载体。在病毒基因组中多角体蛋白基因启动子下游的基因排列顺序为:多角体蛋白基因启动子,SUP4-0,ARS,URA3和CEN。将上述穿梭载体的病毒DNA和外源基因的5'-端为杆状病毒序列、3'-端为酵母ARS序列的转移载体在酵母中发生重组,用外源基因替代SUP4-O基因。而缺失SUP4-O的重组穿梭载体能在含有精氨酸类似物刀豆氨酸(Canavanine)培养基的酵母中生长,因此只要选择到抗Canavanine的酵母克隆,亦即等于筛选到了由多角体蛋白基因启动子控制外源基因表达的重组病毒,省去了繁杂的挑斑过程。最佳情形可在10-12d获得重组病毒。然而该法亦有以下缺点:由于S.cerevisiae的转化频率相对较低,且容易产生假Canavanine抗性,使抗canavanine酵母克隆的筛选较为费时。

1.5 体外重组表达载体筛选系统 噬菌体P1中含有一个特异性的重组系统Cre-Iox.Peakman,应用上述系统构建了体外重组表达载体系统。主要原理如下:噬菌体P1含有一个Cre重组酶,能特异性识别lox P序列,并与之发生重组。Lox P序列的特点为两边各有1个13bp的回文序列,中间被8bp回文结构隔开,将人工合成的LoxP序列通过同源重组转移进NPV基因组,产生重组病毒NPV(lox P +),当含LoxP序列的外源基因的转移载体DNA和NPV(10xP+)rDNA在体外经Cre重组酶的催化时,可发生位点特异性重组,重组率可高达50%,所以转染细胞后,很容易筛选到重组病毒。这个系统由于易筛选到重组病毒,加之仅需一个步骤就能将外源基因从病毒基因组中分离出来。因此,可应用于eDNA文库的构建。但这种方法筛选重组病毒会发生转移载体(外源基因)多次插入到重组病毒及一些与外源基因表达无关的转移载体DNA一并插入到重组病毒,可能对表达量有些影响。此外,该法依然需要挑斑试验和重组病毒的纯化,相对地较为费时。

1.6 大肠杆菌E.coli-昆虫细胞的穿梭载体筛选系统 E.coli-昆虫细胞穿梭载体(bacmid)是迄今为止最为方便、快捷的重组杆状病毒筛选系统。Bacmid既能象质粒一样在E.coli中复制,亦能象病毒一样感染昆虫细胞。Bacmid为一包含有mini-F复制子、卡那霉素抗性筛选标记和细菌转座子Tn 7的靶序列att Tn7e及LacZ片段的重组病毒。 转移载体的作用在此被贡献质粒所取代。贡献质粒设计为含抗庆大霉素基因和多角体蛋白启动子控制的外源基因,两侧分别为tn7的左臂和右臂。同时为了产生位点特异的转座,还需有一个辅助质粒(该质粒为四环素抗性筛选标志)提供转座蛋白。因此,当将bacmid、贡献质粒、辅助质粒转化同一个菌株时,由辅助质粒产生的转座蛋白,将抗庆大霉素基因和多角体蛋白启动子控制的外源基因转座到bacmid的att Tn7序列上,同时破坏了Lac-Z的阅读框架,这样只要将转化上述质粒的菌株在含卡那霉素、四环素、庆大霉素及X-gal和IPTG的LB培养基上筛选白斑即可得到复合Bacmid,将复合Bac-midDNA纯化后转染昆虫细胞,就得到了纯的重组病毒,在昆虫细胞中外源基因在多角体启动子的控制下进行表达。 该系统是目前BEVS中最为方便、快捷的系统,整个重组病毒筛选的周期可缩短为7-10d,且可以连续筛选,因此十分适合于cDNA文库的构建及蛋白质工程研究方面的应用。同时,贡献质粒亦较常规的重组转移载体为小,可以构筑较多的限制性酶切位点和进行改建,以利于外源基因的插入,且贡献载体不仅能适用于BEVS中,亦能适合在其它真核生物表达系统中进行转座,艺表达外源基因。由于转座的免疫性,可以防止外源基因的多次插入。不足之处在于只有12.5kb的外源基因插入多角体蛋白基因位点,而且,插入后可能破坏了多角体启动子工作环境,以致外源基因的表达量较之传统的同源重组纯化的重组病毒略有降低。

1.7 重组拯救缺陷型载体的研究 单纯疱疹病毒I型的胸苷激酶基因(HSVl-TK)能催化核苷酸类似物成为DNA复制的抑制剂。因此,将HSVl-TK基因引入宿主细胞中以产生新的条件致死型。Gross等巧妙地应用TK基因的上述特性,开发了一种新的重组病毒筛选方法。研究发现在核苷酸类似物9-(1.3一,二地羟基-2丙氧甲基)鸟嘌呤(Ganciclovir)浓度直到100rug时并不影响sf-9细胞活力和AcMNPV野生型病毒的复制,将病毒的极早期启动子(1E-1)启动的HSVl-TK基因通过常规的同源重组技术引入Ac MNPV基因组获得重组病毒Ac NPVIE-1-TK,而Ac MNPVIE-1-TK的复制以剂量依赖的方式受到Cancilovir的抑制。在2 uM浓度情况下即可明显抑制AcMNPV IE-1-TK的复制,而在100 mM浓度时,则复制完全受阻。因此,将连接有目的外源基因的转移载体和Ac MNPV IE-1-TK病毒DNA进行共转染时,将子代病毒接种在含50uM Ganciclovir的细胞培养基生长的细胞进行边疆培养,由于只有TK基因已经被目的外源基因所替换的病毒才能良好地生长。因此,只需一轮纯化即可获得目的重组病毒,成功率高达85%以上。虽然,该种方法与前法相比,依然需要一轮筛选,但获得的重组病毒完全与常规相同,并不引起如多角体蛋白基因启动子所处的上游和下游序列改变可能导致的外源基因表达量的降低。同时较一般的筛选法而言,要简单快捷。通过上述工作,杆状病毒的重组病毒获得已成为日常遗传工程操作。

2 研究方向

2.1 改进病毒载体构建外源基因高表达系统 杆状病毒是控制森林害虫密度的主要生物因子,病毒在进化过程中保留或获得了一些非常有利于其繁殖和传播的基因。如胱氨酸蛋白酶和几个质酶,前者在病毒感染的晚期大量表达,分解虫体的组织让虫体容易腐败,从而利于在环境中传播病毒,后者的大量表达,可以破坏虫体的表皮几丁质结构,使虫体液化,达到在环境中大量扩散以利于再次感染。 然而这些基因能够引起表达产物的降解,在活体表达中更能引起虫体组织的溃坏,提前死亡,降低了表达量,增加了纯化难度。贡成良等将BmNPV中的胱氨酸酶基因用半乳糖苷酶替代,以此为病毒表达载体,发病蚕体不易腐败,发现外源基因在蚕体中的表达量得到了提高。 蜕皮甾体葡萄糖基转移酶(egt)基因的编码产物能使蜕皮激素失活,推迟幼虫人眠,引起幼虫持续取食和生长,增加了感染幼虫的病毒繁殖量,利于病毒的进化。BmNPV中的egt基因敲除掉后,与经添食同样量多角体的野生型BmNPV相比,幼虫体重减轻,死亡时间提前了24h左右。显示了egt被敲除掉的修饰病毒作为生物杀虫剂的良好前景。 糖基化可以保护蛋白分子免受蛋白酶分解或维护蛋白质的天然构象,是后加工过程中的重要环节,昆虫细胞的糖基化途径有别于高等的哺乳动物细胞,杆状病毒-昆虫细胞所生产的糖蛋白明显缺少N-连接的末端二个残基分别为半乳糖和唾液酸的残基的双叉寡聚糖链。Jarvcss等针对杆状病毒表达系统的上述缺陷,开发了一套新的表达系统,将糖基化修饰基因置于IE-1启动子控制下,进行表达、修饰昆虫细胞的N-糖基化途径,为生产与哺乳动物细胞表达产物具有相同的N-糖基化蛋白提供了新途径。当然现在利用IE-1启动子的稳定化表达载体亦已建立,可将在昆虫细胞缺少的有关糖基化酶稳定地转化昆虫细胞,用重组杆状病毒在遗传转化修饰后的细胞表达N-糖基化要求高的外源产物,如人促红细胞生成素,不失为一可行的途径。

2.2 改进昆虫细胞培养技术构建外源基因稳定表达系统 昆虫细胞由于体积大,形状较不规整,容易结团,加之病毒感染后细胞膨大1.5倍左右,这些因子增加了昆虫细胞大规模培养的难度。目前已经建立的大规模昆虫细胞培养形式有贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等,其中贴壁培养又可分为滚瓶培养和微载体培养两种;悬浮培养又可分为摇瓶和转瓶,气升式反应器和搅拌式生物反应器;固定化培养是近来发展的一项昆虫细胞大规模培养新技术,对昆虫细胞而言具有两大优点:可有效降低剪切力对细胞的伤害,同时细胞与培液可有效分离,简化了操作步骤,降低了染菌机率。它又可分为微囊化培养和堆积床法培养,其中堆积床法培养综合了各种培养法的优点,昆虫细胞贴壁生长在球状颗粒上,并在气升式反应器的降液区形成堆积床,而升液区则进行深层通气供氧。堆积床法由于可提供高培养表面,同时又能保证充足的供氧,sf细胞用此法培养可达8.6x 107/ml(细胞),是目前的最高细胞培养密度。 在绝大多数情形,用昆虫细胞生产野生型杆状病毒或用BEVS生产外源蛋白质都是作为间歇过程进行的,所有细胞都因病毒感染而死亡。同时BEVS中外源基因的表达常在感染的晚期,高效表达的重组产物的后加工可能是不完全的。另一个明显的缺点是经多次连续传代后,病毒对昆虫细胞的感染力降低,外源基因丢失,产生所谓的缺损病毒,使得连续培养的有效表达时间仅一个月,影响了表达效率。以上两点难以克服的困难限制了昆虫细胞规模化培养的发展,迫使人们寻求其它途径,Jarvis应用病毒的极早期启动子构建了一个稳定表达载体,用IE-1启动子控新霉素基因选择标记,b-gal和人的TPA基因分别作为外源基因表达的研究对象。稳定转化的sf细胞可连续表达100代(一年)以上,b-gal的转化细胞的表达量为2mg/L细胞,仅及用BEVS表达的1%。人的TPA是一种分泌型的糖蛋白,在BEVS中的表达量约为1mg/L细胞,且2/3的TPA留在细胞内,然而用稳定转化细胞的TPA表达量大致与BEVS相同,且全部被细胞分泌出来,转化细胞与被感染细胞的分泌速率比较发现,转化子分泌TPA速度比病毒感染细胞快二倍,亦即昆虫细胞被病毒感染后影响了sf细胞的分泌功能。最近的研究结果亦证实了上述论点,传统的BEVS和稳定表达系统两相比较来看,BEVS适于表达那些非分泌型的糖基化要求不高的表达产物,而稳定表达系统适于表达分泌型的后加工要求复杂的外源蛋白,将后者与无血清培养基开发和无蛋白培养基的开发相结合,不失为传统BEVS的一个有效的补充。鉴于此一前景,最近Invitrogen开发了一个昆虫细胞的稳定表达系统,对转化细胞的选择标记和启动子作了改进。该系统的特点是用对昆虫细胞具有很好杀死能力的Zeocin作为选择标记,可以快速纯化稳定转化的细胞系,选用较强的黄彬毒蛾核多角体病毒(OpMNPV)的极早期基因启动子IZ-2控制外源基因的表达,同时在外源基因的C端融合了易于检测的v5抗原决定簇和便于纯化的多聚组氨酸序列,据称用此载体仅约两周的时间就可获得非裂解、连续表达的稳定转化昆虫细胞系。

2.3 开展自主式昆虫宿主反应器的研究 BEVS系统的外源基因表达虽然表达量高,但它是瞬间的,不能连续高效表达外源产物,迫使人们考虑其解决途径,家蚕丝腺是一个天然的高效生物反应器,每天最高可合成200rug丝蛋白,在短短的4-5d内积累的丝蛋白量可占整个虫体蛋白质总量的70%左右,如此高效的蛋白合成和加工使其自然成为外源基因表达的生物反应器研究对象。杆状病毒的m-1启动子曾用于昆虫细胞的稳定表达,类似的尝试在家蚕中却失败了,因为外源质粒DNA进入卵后,被迅速地降解。在双翅 目昆虫果蝇中P因子是最常用的转基因工具,在家蚕中P因子未显示有转移的能力,将目的基因高效导入蚕体内成为解决应用丝腺生物反应器的关键。张志芳(1993)等发现,AcNPV和重组AcNPV能在蚕蛹内复制并正确表达外源基因HBVSGg,而不显示血液型脓病特有的病理现象;早期蛹注身AcNPV后,其egt基因的表达能够诱导人工滞育蛹的形成,蛹期可达2个月之久,呈潜伏型感染。此种滞育蛹能被人工补助的蜕皮激素所激活。Mori(1995)等发现AcNPV能够对家蚕经卵传递给子代,这均提示了利用AcNPV基因组作为同源重组的载体将外源基因引入家蚕基因组内的可能。最近Yamao用丝蛋白的轻链基因的外显子7的上游5kb序列作为重组的长臂,下游0.5kb序列作为短臂,报告基因GFP插在两者之间。整个嵌合的轻链-GFP基因,通过同源重组引入到AcNPV基因组的多角体蛋白基因区,5x105pfu重组AcNPV感染五龄起蚕,AcNPV选择阳性子代进行纯化固定,获得了转基因蚕,整合率在0.16%左右,测序及Southern杂交和Western分析的结果均表明,轻链-GFP嵌合基因已经定点整合在家蚕基因组并能正确表达。作为载体的AcNPV基因组只能在感染的当代和F1代能检测到。重组AcNPV介导的外源基因技术提供了位点特异的家蚕基因敲除手段,为昆虫基因的结构和功能,大量连续表达外源基因提供了可能。

3 应用前景 杆状病毒表达系统自从问世以来,由于其不具有任何对哺乳动物有潜在的致病性的动物病毒片段,得到了人们的高度重视,美国食品药品管理局对BEVS的评价为"FDA认可BEVS生产的产品,它提供了新兴生物制药业的前景,尤其对于人类疾病治疗和疫苗的开发,改善人类的健康和提高数百万人的生活质量更是如此。早在1987年,FDA就批准美国的Micro-gene Sys公司应用AcNPV表达系统生产的艾滋病基因工程疫苗进入临床试用;在日本1993年就批准家蚕BEVS生产的猫用干扰素产品上市,销售额每年达1000万美元左右;在我国,上海生化所等应用家蚕BEVS生产的人促颗粒一巨噬细胞集落生化因子,显示了良好的促白细胞生长功能,正在进行卫生部的药检审查。仅1999年农业部批准的BEVS表达产品有:武汉大学病毒系的重组苏芸金杆菌伴孢晶体毒素的杆状病毒剂杀虫进行中试,中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点开放实验室的家蚕BEVS生产的重组植酸酶产品进行单胃动物饲养中试实验,浙江农科院蚕研所的家蚕BEVS生产的渔用生长激素饲养实验。由于昆虫和哺乳动物在进化上分歧很远,同源性很差,交叉反应少,对人不存在潜在的生物危害,其表达产物用于免疫学检验具有天然的优势,国外许多生物试剂盒中的标准晶(阳性对照)大部分为BEVS生产的产品。用家蚕BEVS生产的乙肝核心抗原、丙肝核心抗原等均应用于诊断试剂盒。相信随着时间的推移,BEVS系统用途会日益扩展。特别是在药理学、人体病理学、昆虫生理生化学、生物药学及工程病毒杀虫剂开发研究方面的应用将会更加引人注目。

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