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动物有机微量元素吸收机制及吸收研究方法的进展

时间:2014-10-02 15:11:15  来源:  作者:计 峰; 罗绪刚

现代畜牧业生产中,常使用药理效应添加水平无机来源的锌、铜等促进猪生长,结果可能导致环境污染。为减少饲粮中超量微量元素随粪便排泄对环境的污染,研制更有效的微量元素产品已成为微量元素营养研究的热点。20世纪70年代,微量元素氨基酸络合物的研究推动了科学工作者对该类络合物在动物营养中的研究与应用。一些研究显示,金属蛋白盐或络合物的生物学利用率高于其无机物。这一现象引起了人们的注意,对以氨基酸微量元素络合物为代表的有机微量元素的研究方兴未艾。 当人们致力于寻找更为有效的微量元素营养源时,迫切需要一种较为快速、简便和有效的分析方法,以评定微量元素的生物学活性。为此,人们努力尝试在体外模拟胃肠道消化环境和消化后的吸收情况,以期了解元素在体内的吸收。本文综述了有机微量元素的吸收机制和微量元素吸收的研究方法的最新进展,以便深入了解有机和无机元素在动物体内吸收和代谢的异同,为在畜牧业生产中科学、有效地应用微量元素添加剂提供理论依据和方法学指导。

 1 络合态元素的检测方法 有机微量元素产品品质是影响有机与无机微量元素作用效果的重要因素。但无论是AAFCO还是AOAC(美国正式分析化学协会)至今都没有提出鉴别有机微量元素的络合率(即络合态元素的比例)和络合强度(即络合物的稳定常数)的有效方法。 离子选择性电极法、氧化还原电位滴定法、色谱法可用于测定络合体系的络合率。电极法和电位法之类电化学分析方法有很多不足,一是只能间接笼统地测得游离或络合金属离子的总量,而不能直接得到不同分子量分布的络合物组分;二是方法准确度差;由于电位测定法一般要求样品的浓度较低,所以样品大都经过稀释方能测试,而浓度对络合反应影响很大,溶液稀释后络合平衡会发生移动,所以电化学方法的结果不能代表真实情况;三是方法局限性较大。如离子选择性电极法, 目前仅限于Cu2+、Cd2+等少数几种离子有选择性电极,且性能不太稳定;电位法测定要求有和组分离子相同的高纯度金属材料,且必须有很好的氧化还原稳定性,但是电极的制备缺乏标准, 人为因素影响较大(张晓鸣,1999)。Cao(1998,2000)利用凝胶色谱柱对不同分子量物质的分离能力检测缓冲液中游离态和络合态锌,结果表明在pH值为2和5的缓冲液中,有机锌产品的洗脱峰与硫酸锌中锌离子的洗脱峰相同,而对于有机锌产品的中性水溶液,在离子态锌的洗脱峰之前还出现一个较小的洗脱峰,说明此条件下小部分锌为络合态。其后,Guo(2001)证实了这种方法检测游离态和络合态铜的有效性,但是此方法不能检测不溶性部分的络合率。Leach认为,高压液相色谱性(HPLC)及其它分离技术如膜渗透法,常规下无法用于金属络合物,这是由于溶液中的金属络合物总是处于游离金属与配位体的动态平衡状态。该平衡溶液组分的分离可导致络合物快速分解,这种分解通常比HPLC或渗透分析技术更快,这样就会得出有问题的结果。 极谱法可用于测定饱和溶液中有机微量元素的络合强度(Holwerda,1997),但是不能得出游离态和络合态元素的比例,并且在动物的消化道中并不存在饱和溶液。 微生物生长分析法是指在限氮条件下,利用瘤胃微生物降解含氮的有机微量元素产品而生长的情况, 评价有机产品在模拟瘤胃环境下的稳定性(Heinrichs和Conrad,1983),此方法不适用于载体中含氮的产品。 核磁共振、X-光衍射和近红外光谱法用于检测固体样品中有无络合态元素存在(Hynes和Kelly,1995),它只是一种络合态结构的定性分析,不能对络合率或络台强度进行定量分析,而且不适用于液体样品的检测。 上述方法均是测定有机微量元素产品的络合率或络合强度的方法。这些方法能否用于体内(如肠液、黏膜细胞液和血液中)游离态和络合态元素的检测有待于进一步研究。一些学者对体内络合态元素的检测也进行了一些尝试。Hempe等(1989)采用高压液相色谱(HPLC)分离大鼠肠黏膜细胞液和血浆中与65Zn结合的组分,发现饲喂氯化锌与EDTA混合物组的黏膜细胞液比氯化锌组多一个色谱峰(其峰位相应于EDTA锌),而血浆中未发现类似情况。这说明EDTA锌是以完整的形式进入黏膜细胞,通过基底膜时发生解离。David等(1982)用电子顺磁共振(PER)测定出大鼠肝细胞内总Mn2+为35nmol/ml细胞液,游离Mn2+为0.7nmol/m1细胞液,其原理是游离锰(II)在ESR谱图上出现六重超精细谱,而被键合了的锰(II)却没有。此方法能否避免破坏游离态和络合态之间的平衡,能否用于不同样品络合态元素的定量分析,无疑值得深入研究。

2 有机微量元素的吸收机制假说

2.1 完整吸收假说 一种观点是金属氨基酸络合物和其蛋白盐利用肽和氨基酸的吸收机制被完整吸收,而并非小肠中普通金属的吸收机制。此观点的核心是金属离子以共价键和离子键与氨基酸的配位体键合,被保护在络合物的核心,并且金属络合物以整体的形式穿过黏膜细胞膜、黏膜细胞和基底细胞膜进入血液。Evans(1975)认为锌必须和胰腺分泌的小分子量蛋白配体(二肽)形成络合物才能被动物吸收。体外(in vitro)和原位(in situ)研究也表明,当存在大量的半胱氨酸和组氨酸时,它们可与锌生成稳定的络合物,因此可大大增加小肠对锌的吸收和运输(Kirchgessner,1983)。 Ashmead等(1985)的试验结果表明大鼠分离肠段对蛋白质螯合铜的吸收率是硫酸铜的4倍。Lowe等(1994)报道,狗口服蛋氨酸锌的吸收率与氨基酸相似,说明蛋氨酸锌可能以完整形式吸收进入肠上皮细胞,并以完整肽的形式进入循环系统。Koike等(1964)根据双标记锌-EDTA络合物中的65Zn和14C在雏鸡血液中的含量等比例,推断锌-EDTA络合物可完整吸收。而Hill等(1987a)发现,双标记蛋氨酸锌螯合物的'14C和65Zn在鼠外翻肠囊中的吸收不成比例,因此他认为氨基酸锌络合物不能完整吸收,并且在肠囊培养物中添加氯化锌、蛋氨酸锌和赖氨酸锌的结果表明,有机锌和无机锌的生物学效价相似。由于缺乏络合态元素的有效检测方法,以及哺乳动物的食糜的非稳态和肠腔主要参数如pH值和食糜通过率的流动状态,使得研究有机微量元素的吸收机制非常困难。目前尚无直接的试验证据可以证实微量元素络合物或其蛋白盐是以整体形式通过氨基酸或肽的吸收机制被吸收。 

2.2竞争吸收假说 另一种观点(Miller,Ashmead引用,1993)认为,微量元素氨基酸络合物和其蛋白盐能更有效地吸收,并非必须以整体和电中性形式实现。金属络合物中微量元素的吸收利用率高可以用竞争吸收机制来解释。络合程度适宜的有机微量元素进入消化道后,可以防止金属元素在肠道变成不溶性化合物或被吸附在有碍元素吸收的不溶解胶体上,而直接到达小肠刷状缘,并在吸收位点处发生水解,其中的金属以离子形式进入肠上皮细胞并被吸收入血液,因此进入体内的微量元素量增加。这一观点强调的是有机微量元素到达吸收部位的量比无机形态的多。Hynes和Kelley(1995)指出,这种"保护"程度将受到pH值和络合物本身的稳定性的影响。Powell等(1999b)认为,如果配位体大量存在并足够有力地与黏液竞争,金属将促进金属通过黏液层障碍。Aoyagi(1994)在雏鸡饲粮中分别添加蛋氨酸铜、赖氨酸铜和氯化铜,结果表明氨基酸铜络合物和无机盐对吸收抑制剂的反应不同,络合剂可部分减轻L-半胱氨酸和L-抗坏血酸对铜吸收的抑制作用。

3 微量元素吸收的研究方法

3.1 体内法

3.1.1 平衡试验 平衡试验是应用最广泛的方法。通过准确测定元素的食入量和排出量计算元素的表观吸收(食入量-粪中含量)和元素的存留(食入量-粪中含量-尿中含量)。这种方法所需设备简单,可以测定完整日粮中元素的吸收、存留,并能为估计元素的需要量提供有用的信息。但平衡试验有低估元素吸收的趋势。因粪中有来自胰腺、胆管和肠道分泌的内源部分;且测定进食量和排出量时小的误差会引起计算存留时的大误差,元素吸收水平低时更是如此(Wienk等,1999)。虽然可以通过延长试验期、增加试验动物数量来提高试验的精确性,但会消耗大量的人力、物力和财力。此外,平衡试验多用于研究全价饲粮,对于单一饲料则由于其不能提供动物以全价的营养,使动物处于非正常营养状态下,所以平衡试验用于研究单一饲料原料中某种元素的吸收是有局限的。 尽管平衡试验不能提供关于元素吸收部位的任何信息,但平衡试验毕竟是经典的测定表观吸收的方法。使用该方法,动物处于自然生长状态,其试验结果最接近动物自身情况,对生产实际具有指导意义,是与其他研究方法相比较的参照方法。

3.1.2 同位素示踪技术 20世纪50年代,放射性同位素技术开始广泛应用于动物代谢和临床研究(商照荣,1992)。同位素技术的主要优点有:(1)灵敏度高,放射性的检测水平可达10-18~10-19g,而普通化学分析法的灵敏度只有10-12g;(2)操作简单,可直接测定样品,不需要繁琐的前处理;(3)放射性核素的引入量低,比较接近动物体正常的生理状态(董晓蕙,2001)。 同位素示踪技术大大提高了试验的准确性,平衡试验中若引入放射性同位素,可以测定元素的真吸收率。Weigand(1980)给大鼠饲喂5.6~141 mg/kg 6种水平锌,发现锌的真吸收率随锌水平的升高而增加。但是,由于饲料本身所含的天然标{己物(内源性标记)极少,所以使用同位素示踪技术的前提是向饲料中添加的标记化合物(外源性标记)和内源元素可以完全混合,通过测定同位素的分布能够了解元素在动物体内的代谢途径。然而,有试验表明二者之间存在显著差异(Bedi等,1982;Neathery等,1975;Meyer等,1983;Fairweather-Tait等,1991;Janghorbani等,1982)。放射性同位素进入体内贮备库后,放射性被稀释,有可能低估实际值,因此对其结果的解释应慎重。 目前人体试验多使用稳定性同位素,稳定性同位素可避免射线对试验对象的伤害,是一种较为安全的方法。有些元素如锌和硒具有几种稳定性同位素,而某些微量元素如铝、锰和钴等只有一种稳定性同位素,因此,建立在同位素比率基础上的稳定性同位素测定方法(质谱法)不能用来研究这些元素的吸收。另外稳定性同位素的检测较放射性同位素更为困难,代价更高。 将同位素示踪技术与其他的试验方法结合起来,可更准确地研究元素的吸收、利用和影响因素。

3.1.3 原位结扎灌注技术 原位结扎灌注技术是指将动物麻醉后,打开腹腔,将试验肠段两端结扎,肠段中注入含有待测元素的灌注液,一段时间后,通过测定灌注液中元素的消失率、结扎肠段黏膜、血液及组织器官中元素的出现率来估计其吸收、转运和利用。Hempe和Cousins(1989)用结扎鼠十二指肠环技术研究了螯合剂EDTA和蛋氨酸对65Zn吸收利用的影响,发现螯合物中的65Zn较氯化锌的吸收明显减少,锌-EDTA以完整形式从肠腔进入黏膜细胞,但是不能通过肠道基底膜。然而,结扎肠段限制了消化产物在肠道内的流动。由于结扎肠段阻断了小肠的蠕动,Naveh(1988)、Wapnir(1986)、Antonson(1979)等人在试验中通过套管将结扎肠段同蠕动泵连接起来,组成一个循环系统来研究吸收、转运和利用。Steel(1985)、Hoadley(1987)、Smith(1978,1980)等人在结扎肠段的同时,结扎肠系膜动脉和门静脉,构成肠段、血管两个循环系统进行试验研究。他们指出同时结扎灌注肠管和血管,血管中的元素直接反映了元素在肠道中运输的终点,并且血管灌注物可以不断地带走转运到浆膜层的元素,所以血管流出物中的元素代表了从肠腔进入血管的单方向的流量。但是,这种方法也存在一些问题,如肠段充血和分泌过多(Smith等,1978)。Windmueller等(1977)通过持续灌输地塞米松或去甲肾上腺素克服了上述问题。

3.2 体外法 体外法主要有4种:外翻肠囊、体外灌注肠段、小肠刷状缘膜微粒(BrushBorder Membrane Vesicles,BBMV)和细胞培养。体外试验的优点是:可控制试验条件,准确度较高,干扰因素较少,所以体外试验结果较体内试验结果的变异小;其次,试验时间短、成本低。但是,体外模型是处于非正常生理状态下的,其结果能否用于说明体内情况,必须用体内试验证实。

3.2.1 外翻肠囊 外翻肠囊技术是在体外培养肠环技术的基础上发展而来的,即从活体取出小肠后分割成不同的片段,将各片段外翻做成囊状物,放入培养液中培养一段时间后,取出放进装有被测物的烧杯中,观测肠道黏膜、浆膜及肠囊中被测物的变化(Willson和Wiseman,1954)。Seal等(1983)利用大鼠十二指肠和回肠的外翻肠囊研究有机配位体对锌吸收的影响,认为外翻肠囊技术是研究影响锌吸收的物质的有效手段。该方法操作简单、快速,能详细地观察到元素进出肠段的变化。但该方法是在没有血液供应的非正常生理条件下进行的,黏膜没有营养供应,其功能未必能完全发挥,而且黏膜摄入的元素无法转运。

3.2.2 体外灌注肠段 体外灌注肠段是指从活体取出所需要的肠段,放入充氧的培养液中,并将游离肠段与连续灌注装置相连,通过测定培养液和肠段中的元素含量来了解其吸收和摄取情况。Sahagianc(1967)将游离肠段和一种灌注仪器连在一起,在肠段内外两侧投放不同的灌注液, 测定了锌的吸收和转运。Hill等(1987b)用猪和鸡的体外连续灌注肠段检测氯化锌和蛋氨酸锌的吸收情况,发现猪对这2种锌源的吸收相似,鸡对氯化锌的吸收较多。2种锌源的吸收和运输速率可能不同,他们认为这种非外翻灌注法对肠段造成的损伤较小,可能更符合动物正常的生理状况,但这种方法需较为复杂的仪器。

3.2.3 小肠刷状缘膜微粒 小肠刷状缘膜微粒技术是一种研究刷状缘对元素摄入的方法。将所研究的肠段取出后,将黏膜轻轻刮下,经离心等一系列处理后得到刷状缘膜微粒,通过蛋白和特殊酶活的测定来判定刷状缘制品的纯化程度。刷状缘制品在培养液中培养一段时间后,快速过滤,通过测定滤纸上的放射性来估测刷状缘对元素的摄入。Oestreicher(1989)用该方法制备了基底膜微粒,研究锌在基底膜的转运,发现该步骤可能有能量的限制。应用此技术的优点是,可以控制能量的供应,减少复杂因素,如细胞内的代谢和隔室化。

3.2.4 细胞培养 细胞培养技术是指从动物体内取出细胞,模拟体内的生理环境,在无菌、适当温度和一定营养条件下,使细胞生存、生长并维持其结构和功能的方法。该方法具有许多优点:

1)细胞均质,类型单一,对外界影响的反应一致;

2)细胞可直接暴露在预测试剂中,能直接观测反应,可供比较不同因素或同一因素不同剂量对同一种细胞的作用。

将细胞培养与同位素示踪技术有机结合在国外已获成功(Glahn,1997)。近年来,我国细胞生物学技术发展很快,使得将细胞培养用于动物营养研究成为可能。唐善虎等(1991)认为,与评定鸡体锌营养状况常用指标比较,血细胞在体外对65Zn的摄取作为反映锌营养状况的指标有较好的灵敏度,且不受血浆中营养成分变化的影响。 在细胞培养模型中,Caco-2细胞系(human colon adenocarcinoma cell line)使用最多(Wienk,1999)。它自动分化,表现出小肠细胞的许多特性,包括极化、形成刷状缘微绒毛和相关的水解酶,并且基底膜具有Na+,K+-ATP酶和激素受体(Hidalgo等,1989;Pinto等,1983)。因此,Caco-2细胞是研究微量元素在小肠的吸收和转运的有用工具。

采用Caco-2细胞的不利之处在于:

(1)它们是人的结肠癌细胞,对于这些细胞保持正常代谢过程的程度尚不了解;

(2)缺少黏液层,而粘液层在小肠的吸收过程中起着重要作用;

(3)它们代表结肠的特性;(4)载体低表达,使得运输速率很低。

Matsui(1999)用Caco-2细胞通道比较了氨基酸螯合锌和硫酸锌的吸收利用情况,发现无机锌较有机锌能更有效地被肠细胞吸收,但是有机锌的转运效率高于无机锌,说明有机锌和无机锌进入了肠细胞的不同部位。已知无机锌在肠细胞细胞质中与金属硫蛋白形成络合物,虽然金属硫蛋白对锌吸收的确切作用尚不明确,但认为这会干涉锌在细胞内的转运。据推测,金属硫蛋白能束缚无机锌,却不能束缚有机锌, 因此有机锌较易被转运。Glahn等(1996)将体外消化和Caco-2细胞培养结合起来研究食物中铁的吸收,他认为此模型可用于筛选具有较高生物学利用率的矿物元素源。 因为内皮细胞与血浆直接接触,并且是所有营养物质进入外周器官和组织必须通过的屏障。Bobilya(1991)用牛肺动脉内皮细胞研究了锌的摄入和分泌模型及细胞内交换池的大小。Beutler(1998)研究了人小肠上皮细胞对氯化锌、蛋氨酸锌和丙酸锌的摄取能力,未表现出明显差异,而锌-EDTA络合物中的65Zn的吸收明显减少。 尽管细胞培养技术可以很直观地观察细胞的反应,但人工培养环境下的细胞反应和体内细胞环境相比仍有很大差异,因此在利用培养细胞做试验对象时,不应视为与体内细胞完全一样,把试验结果由体外推到体内。 综上所述,研究元素吸收、代谢的技术多样,所需的试验条件各不相同,研究者可根据自身的研究目的和所具备的试验条件来选择适宜的试验方法。

4 有待进一步研究的问题 因为络合态微量元素的检测一直是困扰各国学者的一大难题,所以目前有关有机微量元素吸收机制的研究报道很少。仅有的几篇报道其结果也不完全一致,均与研究方法不同有关。 今后有必要探讨有机微量元素中游离态和络合态元素的检测方法,对不同体外研究方法的结果进行比较,并通过体内方法验证体外法研究有机微量元素的吸收和利用是否可行, 以便深入了解有机和无机元素在动物体内吸收和代谢的异同,为在畜牧业生产中科学、有效地应用微量元素添加剂提供理论依据和方法学指导。

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